EMSA样品制备

  

一、EMSA对样品的要求。

做EMSA要求样品中有天然的有活性可检测量完整DNA/RNA结合蛋白(结合蛋白)。样品中没有合用的结合蛋白,EMSA就是无的放矢。

二、EMSA样品的类型。

EMSA测定的一大优点就是可以从核抽提液中测出相应的结合蛋白,而不需对目标蛋白进行纯化。如果细胞或组织有持续活化的结合蛋白,样品可以是胞浆液或全细胞溶胞液。EMSA样品也可以是纯化或部分纯化的蛋白,甚至使用体外翻译系统(一般用麦胚抽提物作哺乳细胞转录因子(TF)的体外翻译)。不管采用什么样品,其中的结合蛋白都必须有DNA/RNA结合活性才行,

三、EMSA样品的常见问题

1. 没有DNA/RNA结合蛋白

准备样品前,最好查文献确认所用的细胞或组织有没有目标分子。没有目标分子的细胞或组织需要导入外源性的表达载体,并测定目标分子的表达量。

e乐彩通用版登录手机版旧版本2. DNA/RNA结合蛋白没有被活化

细胞没有活化的TF可有以下原因:1)大多数TF在细胞内都处于没有活性的状况。2)经过生物、理化因子刺激而活化的TF仅持续一定时间,几个小时又转为阴性。3)细胞刺激时间与剂量有误,也不能活化TF。4)即使刺激方式与时间正确,一些细胞可能缺乏相应表面受体或细胞内效应分子而无法活化TF。

e乐彩通用版登录手机版旧版本 TF活化涉及一系列生物化学反应,包括蛋白磷酸化反应,蛋白质降解,多聚体形成,核转运等。一般还涉及到其它调节蛋白的参与。依据不同的实验以及不同刺激方式,对细胞的处理时间与药物的处理剂量会有所不同,一般可以通过查看文献来确定。如果使用Viagene的EMSA产品与服务,我们会结合客户的情况提出具体建议,成功率会高很多。

3. 样品中的结合蛋白被降解

处理细胞,应当在低温下操作,所有缓冲液与溶液都应预冷,并带蛋白酶抑制剂。制备好的样品需要在深低温保存。

e乐彩通用版登录手机版旧版本4. 结合蛋白在纯化过程中失活

在细菌中表达目标蛋白,一些会变成不溶性,复性过程可能影响蛋白活性。因为很多结合因子在多聚体条件下才有活性,复性过程可使目标蛋白因子解聚而丧失活性。

e乐彩通用版登录手机版旧版本5. 在细菌中表达的蛋白没有活性

e乐彩通用版登录手机版旧版本 一些蛋白因子的活性涉及到翻译后修饰,如多糖链等。当这些蛋白因子在细菌表达,细菌体系不能对表达分子进行相应修饰。这种情况下,即使表达的蛋白是可溶的并有恰当的立体天然构型,但不具有DNA/RNA结合的活性。

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Viagene公司提供各种EMSA技术服务e乐彩通用版登录手机版旧版本,包括为客户制备EMSA样品。我们的技术服务做有以下特点:1)我们的经验丰富,能够帮助客户分析解决各种问题。2)出结果快,一般5-7个工作日出结果;3)我们有各种EMSA阴性、阳性对照。在同一片凝胶中同时分析阳性与阴性对照,客户样品的EMSA结果一目了然。4)我们有各种软、硬条件,能够查出EMSA测定中的问题。 

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